Las infecciones respiratorias agudas son enfermedades respiratorias comunes en los niños, a menudo causadas por virus. El virus sincitial respiratorio (RSV) y el adenovirus respiratorio (ADV) son dos patógenos comunes que causan infecciones respiratorias agudas en los niños. Los casos leves pueden causar síntomas fríos comunes, como la tos y la nariz líquida, mientras que los casos graves pueden causar complicaciones graves como la neumonía y la otitis media. Según las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud, la detección de patógenos debe ser rápida, precisa, sensible y específica y no debe confiar en técnicos especializados o grandes instrumentos. Por lo tanto, es particularmente importante desarrollar un método de detección para RSV y ADV que puedan cumplir con los requisitos de detección anteriores.
El Grupo de Investigación del Director Ma Dongli del Instituto de Pediatría del Hospital de Niños Shenzhen publicó un artículo "Un ensayo de amplificación de la polimerasa de recombinasa multiplex combinada con CRISPR/ CAS12A para la detección de virus sincitial respiratorio y adenovirus respiratorio" en la revista "Informes científicos", con un factor de impacto de 4.6.
Descripción general de la investigación
La tecnología de amplificación de ácido nucleico rápida isotérmica multi-enzima se combina con el sistema de detección CRISPR/CAS. Al diseñar cebadores Mira y ARN CRISPR (CRRNA), realizar comparaciones de secuencias múltiples, optimizar las condiciones de reacción y usar dispositivos de detección numérica de fluorescencia para verificar la sensibilidad y la especificidad.
Y utilizando los resultados de QPCR como control de comparación, se estudió la consistencia de los resultados de la prueba de 160 muestras de hisopos de garganta clínica.
Resultados experimentales
1. Sensibilidad y especificidad del método de detección de Mira-CRISPR/CAS12A
En la detección del método MIRA, el par de cebadores RSV-F1/R1 se usa para amplificar los ácidos nucleicos a partir de muestras de hisopos de garganta de pacientes con RSV, PIV, RHV, MP, CP, Flub, HMPV, FLU o RSV/ADV/ADV. A excepción de RSV y ADV, que tenían bandas amplificadas, los otros resultados fueron negativos, lo que indica que los cebadores Mira seleccionados no reaccionaron cruzados con los otros ocho patógenos probados y estaban bien conservados.
Posteriormente, los plásmidos recombinantes RSV y ADV se diluyeron 10 veces usando agua estéril, y los límites de detección para RSV y ADV fueron 10 106copias/ml.
(1-10: muestras de hisopos de garganta de pacientes con RSV, coinfección de RSV/ADV y otras muestras de patógenos respiratorios respectivamente)
2. Comparar con QPCR
En comparación con el método QPCR, los límites de detección de RSV y ADV son 103 copias/ml
(Sensibilidad de la detección de QPCR de RSV y ADV)
El método MIRA-CRISPR es más adecuado para laboratorios de base, con breve tiempo de detección, operación simple y sin necesidad de instrumentos QPCR a gran escala para completar las operaciones experimentales.
3. Comparación de muestras clínicas
Se recolectaron muestras de hisopos de garganta de 160 niños con infecciones respiratorias agudas. Al mismo tiempo, se usaron el método MIRA-CRISPR y el método QPCR para la detección, y los resultados se compararon con los resultados del ensayo clínico.
En comparación con el método QPCR, la sensibilidad del método MIRA-CRISPR para RSV y ADV fue 98.1% y 91.4% respectivamente, y la especificidad de detección fue 1 0 0%. El valor de Kappa es mayor que 0.95, lo que indica un alto grado de consistencia.
El método MIRA-CRISPR tiene las ventajas de la detección rápida, sensible y específica de RSV y Adv. Puede detectar infecciones virales de manera rápida y precisa, y es más adecuado para su uso en áreas con escasos recursos médicos.