Aeromonas hydrophila es una bacteria patógena importante en la acuicultura, que causa enfermedades graves en los animales de granja y provoca pérdidas económicas sustanciales. Para permitir una detección rápida en el sitio-, desarrollamos una plataforma de microfluidos portátil que integra la amplificación rápida isotérmica multienzimática (MIRA) con el manejo automatizado de fluidos. El diseño del chip incorporó un motor de vibración en miniatura y almohadillas térmicas de cerámica para mantener
control preciso de la temperatura y garantice la homogeneidad de la reacción durante toda la extracción y amplificación del ácido nucleico. Una bomba de aire en miniatura impulsó el extracto crudo de ADN a través del chip en un solo paso de pipeteo para obtener resultados precisos.cuantificación. Posteriormente, el ADN extraído se transfirió a una cámara de reacción precargada con MIRA.reactivos para amplificación isotérmica a 39 grados bajo monitoreo de fluorescencia en tiempo real-. Esta plataforma detectó
A. hydrophila en muestras de agua en 40 minutos, logrando un rango lineal de 1 × 10² a 1 × 10⁷ UFC⋅mL−1y un límite de detección (LOD) de 10 CFU⋅mL−1. En particular, su diseño modular permite un fácil intercambio de cebadores y sondas, lo que hace que la plataforma sea fácilmente adaptable para detectar diversos patógenos bacterianos en la acuicultura.
Comparación esquemática de la plataforma de microfluidos portátil y la plataforma de detección convencional para A. hydrophila. (A) El microfluido portátil.
plataforma. El flujo de trabajo de detección en esta plataforma integra extracción de ácido nucleico, pipeteo preciso, amplificación y detección. (B) La plataforma de detección convencional. El flujo de trabajo convencional basado en el laboratorio-se basa en equipos sofisticados, personal capacitado y procedimientos-que requieren mucho tiempo.
Evaluación de estabilidad de la plataforma de microfluidos portátil. (A) Fotografía de la plataforma de microfluidos portátil. (B, C) Rendimiento térmico de las cámaras de extracción y detección de ácidos nucleicos. Relación entre la almohadilla térmica cerámica y la temperatura de la cámara. (D) Estabilidad de detección de fluorescencia (N=3). La intensidad de la fluorescencia se midió a intervalos de 5 minutos durante todo el proceso de amplificación.
Evaluación del desempeño de la plataforma de microfluidos portátil. (A) Curva de calibración para la detección de A. hydrophila (N=3). Se estableció una curva de calibración detectando A. hydrophila en un rango de concentración de 1 × 101 –1 × 108 UFC⋅mL−1en condiciones óptimas. (B) Evaluación de reproducibilidad de chip-a-chip. El ensayo MIRA para A. hydrophila se realizó en diez chips fabricados a partir de cada uno de dos moldes independientes. (C) Análisis de especificidad (N=3). La especificidad del ensayo MIRA se validó frente a la A. hydrophila objetivo y 11 especies bacterianas no objetivo. (D) Comparación con qPCR (N=3). Tanto la plataforma como la qPCR se utilizaron para detectar A. hydrophila en diversas concentraciones. (E) Detección de cepas aisladas en campo-(N=3). Se detectaron cuatro cepas-aisladas de campo de A. hydrophila utilizando tanto la plataforma como la qPCR.