Staphylococcus hemolyticus es una bacteria gram-positiva de coagulasa negativa que es muy común en los hospitales. En los últimos años, ha habido una preocupación cada vez mayor debido al alto riesgo de infecciones adquiridas en el hospital. Staphylococcus hemolyticus puede causar aún más infecciones de la piel, meningitis, peritonitis e incluso sepsis. Los retrasos en el diagnóstico clínico pueden conducir a un deterioro en las condiciones de salud, por lo que el diagnóstico rápido de Staphylococcus hemolyticus es clave para el tratamiento preciso.
El Grupo de Investigación del Profesor Ji Tuo del Departamento del Laboratorio Central del Hospital Lianyungang Second People publicó un artículo "Una detección rápida y visual de Staphylococcus hemolyticus en muestras clínicas con Mira-LFS" en la revista "Analytica chimica Acta", con un factor de impacto de 6.2.
Descripción general del estudio
En este estudio, el grupo del Prof. Ji Tuo estableció un método para la detección de Staphylolyticus hemolyticus por MIRA-LFS basado en el gen MVAA, y utilizó la tecnología de amplificación de ácido nucleico rápido de temperatura constante de múltiples enzimas Combinada con LFS de flujo de flujo de flujo lateral para lograr una detección de patógeno rápido. El experimento se realizó a 37 grados y los resultados se detectaron dentro de los 9 minutos con una sensibilidad de detección de 0. 147 CFU/reacción. El método de detección de Mira-LFS es adecuado para la detección de puntos fijos de Staphylococcus hemolyticus en muestras clínicas, y realiza el método de identificación de Staphylococcus hemolyticus por POCT, que es de gran valor para el diagnóstico y tratamiento rápidos de las enfermedades en las áreas subrayadas. El grupo de investigación utilizó Mira-LFS, QPCR y métodos tradicionales de cultivo bacteriano para analizar 95 muestras clínicas aleatorias y confirmó la aplicabilidad clínica.
Métodos de investigación
Se muestra un diagrama esquemático de la prueba Mira-LFS arriba. En este estudio, se utilizaron el kit de amplificación rápida de temperatura constante de ADN de ADN de ADN (tipo de prueba de prueba de oro coloidal) y tira de prueba de detección de ácido nucleico.
La longitud del cebador del gen MVAA fue 30-35 nucleótidos, y la longitud del producto de amplificación fue 100-350 BP, y se diseñó un total de 6 pares de cebadores candidatos. El GDNA de las cepas Staphylolytic Staphylococcus estándar se usó para el análisis MIRA, se seleccionaron los cebadores candidatos y los productos amplificados se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.
(Los productos de amplificación se muestran utilizando electroforesis en gel de agarosa)
La sonda se diseña de acuerdo con la secuencia del cebador directo (16 pb hacia atrás). El extremo 5 'de la sonda está etiquetado con FITC y el extremo 3' está etiquetado como C3. El nucleótido de posición 31- en la sonda se reemplaza con THF a una distancia de 30 pb desde el extremo 5 'y 15 pb desde el extremo 3'. El extremo 5 'del cebador inverso seleccionado está marcado con biotina.
(Diagrama esquemático de modificación de dímero cruzado y secuencia de combinaciones de empobrecimiento de cebadores)
Además, se optimizaron las condiciones de reacción para la detección de Mira-LF por Staphylococcus hemolyticus. Las pruebas se realizan a 37 grados desde 4-12 min a intervalos de 2 minutos. Los resultados se muestran en el tiempo de reacción de 8 minutos, y la línea de prueba es claramente visible. Además, la prueba se realiza desde 22-52 grado a intervalos de 5 grados. 37-42 Grado es la temperatura más adecuada para la detección de Mira-LFS. Por lo tanto, el tiempo de reacción óptimo y la temperatura del método Mira-LFS para Staphylococcus hemolyticus fueron 8 minutos y 37 grados, respectivamente. Junto con el hecho de que el resultado final es visualizado por LFS en 1 minuto, el tiempo de detección total es de 9 minutos.
(Optimización del tiempo de reacción y la temperatura)
Resultados experimentales
1. Verificación de sensibilidad
Se probaron diferentes concentraciones de ADN genómico (GDNA) de las diluciones en serie de cultivos de Staphylococcus haemolytica (1 0^6-10^0 CFU/ml) para MIRA-LFS.
(Señal positiva a diferentes concentraciones)
El análisis de regresión de la unidad probabilística mostró que el 95% LOD determinado por el ensayo Mira-LFS fue 0. 147CFU/reacción.
(Límite de cálculo de detección)
2. Validación de especificidad
La selectividad de la detección de Mira-LFS se determinó analizando 18 cepas de microorganismos patogénicos comunes y 15 cepas de Staphylococcus hemolyticus clínico. Los resultados mostraron que la prueba Mira-LFS fue negativa para todas las 18 bacterias patogénicas, y positivo para 15 muestras clínicas verificadas de Staphylococcus hemolyticus.
(Se probaron 8 cepas de bacterias patógenas estándar y 15 cepas de estreptococos hemolíticos clínicos, respectivamente)
El ensayo Mira-LFS tiene una alta selectividad y es adecuado para la detección de Staphylococcus hemolyticus.
3. Prueba de muestra real
Un total de 95 muestras se recogieron al azar del Hospital Lianyungang Second People, incluidas 35 muestras de piel y tejidos blandos, 16 muestras de orina, 14 muestras de esputo y 30 muestras de sangre.
(95 muestras clínicas fueron probadas por diferentes métodos)
Los resultados mostraron que el método de detección era 100% consistente con el método QPCR. Además, en comparación con el estándar de oro (GB/T4789. 11-2003), la sensibilidad y la especificidad del ensayo Mira-LFS para la identificación de la infección por Staphylococcus haemolytica fueron 100% y 98.73%, respectivamente. Estos resultados validan aún más la viabilidad técnica del método en la detección de Staphylococcus hemolyticus en muestras clínicas.
El método Mira-LFS se usa para la detección rápida de Staphylococcus hemolyticus por POCT, que es eficiente, preciso, simple y rentable, que es útil para el diagnóstico rápido y las decisiones de tratamiento.