El artículo propone una nueva tecnología de chips microfluídica para la detección multiplex de microorganismos patógenos de camarones. El equipo de investigación integró la tecnología de amplificación de ácido nucleico rápido isotérmico (MIRA) de múltiples enzimas (MIRA) y métodos de detección de fluorescencia en tiempo real. Este chip microfluídico proporciona una solución rápida, sensible y eficiente para la detección en el sitio de patógenos de camarones mayores.
Antecedentes de investigación e importancia
La industria global de la agricultura de camarones es uno de los componentes económicos más importantes de la acuicultura, pero la industria ha enfrentado durante mucho tiempo las amenazas de una variedad de microorganismos patógenos. Estos patógenos a menudo conducen a la muerte a gran escala de camarones, afectando seriamente la producción y los beneficios económicos. Incluyendo enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND), virus del síndrome de mancha blanca (WSSV), virus de la necrosis hipodérmica infecciosa y necrosis hematopoyética (IHHNV), hemocitos iridovirus (SHIV) y la industria enterohepática (EHP), etc. Virus, bacterias y parásites Pleose Pleose Pleoss Pleoss Pleoss Pleoss Benicatss.
Los métodos de detección de patógenos tradicionales, como la reacción en cadena de la polimerasa (tecnología de PCR), tienen una alta sensibilidad y especificidad, pero son complejos de operar, tomar mucho tiempo y confiar en equipos de laboratorio. Estas limitaciones hacen que la tecnología de PCR sea inadecuada para pruebas rápidas en el sitio. La tecnología Mira se ha convertido en una herramienta de detección molecular adecuada para la aplicación en el sitio debido a sus características de amplificación rápidas bajo temperatura constante y temperatura normal.
Principio de la tecnología Mira
La tecnología de amplificación de ácido nucleico rápido de temperatura constante multi-enzima (tecnología MIRA) es una tecnología de amplificación de temperatura constante que se basa en la sinergia de múltiples proteínas funcionales a temperatura ambiente para lograr una amplificación rápida de los ácidos nucleicos. Es una tecnología de detección de ácido nucleico rápido en el sitio verdaderamente portátil. En comparación con la PCR, Mira tiene más ventajas.
Diseño e innovación de chips microfluídicos
Diagrama esquemático de la plataforma de detección RPA en ChIP para varios microorganismos patógenos de camarones importantes
(A) Estructura de un chip microfluídico de tipo disco. 1: cámara de reacción; 2: válvula de bola; 3: puerto de escape; 4: puerto de muestreo;
(B) Vista explotada. 5: Película de sellado de calor; 6: sustrato de chip.
(C) Diseño detallado de los seis conjuntos de cebadores dentro del sector. Cada conjunto de cebadores se fija en una cámara de reacción designada.
(D) Procedimiento operativo completo de la plataforma de detección RPA en chip.
El artículo propone un chip microfluídico integrado con la tecnología Mira para la detección multiplex de microorganismos patógenos de camarones. La tecnología microfluídica puede controlar los líquidos dentro de los canales a nivel de micrones para una manipulación precisa, lo que logró una detección de objetivos múltiples eficientes y de bajo costo.
El chip tiene las siguientes características de diseño clave:
● chip microfluídico centrífugo
El ChIP adopta un diseño de accionamiento centrífugo, utilizando fuerza centrífuga para distribuir uniformemente la muestra en cada cámara de reacción. Este diseño simplifica el proceso de operación, y el operador puede completar toda la reacción simplemente inyectando la muestra.
● Detección de objetivos múltiples
El chip está preestablecido con los tipos bacterianos que deben detectarse: necrosis hepatopancreática aguda (V-AHPND), virus del síndrome de mancha blanca (WSSV), necrosis subcutánea infecciosa (EHP) (IHHNV), iridovirus de hemocito de camarones (SHIV) y enterohepatitis (EHP). ) Probaciones de cebador para cinco patógenos. Este diseño puede detectar simultáneamente seis objetivos genéticos en una reacción, lo que permite una detección rápida de múltiples patógenos.
● Detección de fluorescencia en tiempo real
La reacción de amplificación de la tecnología Mira en el chip se combina con una sonda fluorescente, que puede monitorear el progreso de la reacción de amplificación en tiempo real. El diseño de la sonda permite que la señal fluorescente se libere solo cuando se genera el producto de amplificación, logrando así una detección cuantitativa rápida y sensible.
● Sistema de reacción de baja concentración
Cada unidad de reacción del chip solo requiere un volumen de reacción de 5 μl, lo que reduce en gran medida el consumo de reactivos. Cuando se ejecuta todo el sistema, hasta cuatro muestras se pueden procesar simultáneamente, y cada muestra puede detectar cinco patógenos, mejorando en gran medida la eficiencia de detección.
Sensibilidad, especificidad y repetibilidad
El rendimiento del sistema ChIP incluye la detección de simetría, resonancia y repetibilidad.
● Sensibilidad
Los resultados experimentales muestran que el chip puede detectar números de copias del gen objetivo tan bajos como 10 copias/μl, con sensibilidad que es comparable o incluso más alta que los métodos de PCR tradicionales. Esta alta sensibilidad garantiza que la tecnología pueda detectar a las personas infectadas temprano en aplicaciones prácticas, lo que permite la detección temprana de los patógenos.
● Especificidad
El experimento realizó pruebas de reacción cruzada en una variedad de patógenos no objetivo, y los resultados mostraron que el chip es altamente específico para los patógenos objetivo y puede distinguir con precisión varios tipos de patógenos. Todas las pruebas para la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda (V-AHPND), el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV), el virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (IHHNV), el virus de la iridescencia hemacítica (SHIV) y la entero de la entero. Amplificación no específica.
● Repetibilidad
Para evaluar la estabilidad del método, el equipo de investigación realizó múltiples experimentos repetidos. Los resultados mostraron que el coeficiente de variación (valor CV) entre diferentes experimentos fue inferior al 10%, mostrando una buena repetibilidad experimental y consistencia.
Aplicaciones y ventajas de campo
El diseño del chip microfluídico de tecnología Mira le brinda importantes ventajas de aplicación de campo, especialmente adecuadas para la detección rápida y el monitoreo de los patógenos en la agricultura de camarones:
● Proceso de operación conveniente
Todo el proceso de detección solo requiere inyectar la muestra en el chip e iniciar el dispositivo de reacción. No requiere casi ninguna operación manual y es adecuado para que los no profesionales lo usen en el sitio.
● Capacidad de respuesta rápida
El sistema puede obtener los resultados de las pruebas en 20 minutos, acortando en gran medida el tiempo de prueba. Esto es crucial para la respuesta rápida de la enfermedad en las granjas y la reducción de la propagación de los patógenos.
● Capacidad de detección multiplex
Se pueden identificar cinco patógenos principales en una prueba, lo que mejora enormemente la eficiencia de detección y ahorra costos de detección y tiempo.
Perspectivas de tecnología de Mira
Aunque la tecnología de PCR ha sido calificada durante mucho tiempo como el estándar de oro para la detección de amplificación de ácido nucleico, la tecnología MIRA ha demostrado un gran potencial de aplicación debido a su reacción rápida a temperatura constante, operación simple y bajos requisitos de equipos. Al compararse con la PCR combinada con la secuenciación de ADN, se encontró que los resultados de detección del chip de amplificación isotérmica son consistentes con los resultados de PCR en términos de sensibilidad y especificidad, y el tiempo de reacción de la tecnología MIRA se acorta significativamente. Por lo tanto, los chips microfluídicos de tecnología MIRA se consideran una tecnología más adecuada para aplicaciones de campo, especialmente en entornos que requieren una detección de patógenos rápidos y a gran escala.
Los chips microfluídicos basados en la tecnología de amplificación de ácido nucleico rápida isotérmica múltiple (MIRA) proporcionan una herramienta efectiva para la detección de microorganismos patógenos en la agricultura de camarones. Esta tecnología tiene las ventajas de alta sensibilidad, buena especificidad, fácil operación y velocidad de detección rápida, y tiene amplias perspectivas de aplicación en la prevención y control de enfermedades de la acuicultura. Con un mayor desarrollo y optimización de la tecnología, se espera que el sistema se aplique a la detección de más patógenos acuáticos, lo que permite una prevención y monitoreo de enfermedades más amplias.
Los resultados de la investigación proporcionan un método de detección temprana confiable para la industria de la acuicultura, que puede reducir efectivamente el riesgo de brotes de enfermedades, mejorar la eficiencia de producción y la producción de las granjas, y establecer una base técnica para el desarrollo sostenible de la industria de la acuicultura.