¿Cómo medir la polarización de fluorescencia?

La polarización de fluorescencia (FP) es una técnica poderosa utilizada en varios campos, incluidas la bioquímica, la farmacología y la ciencia ambiental. Como proveedor de detector de fluorescencia líder, entendemos la importancia de mediciones de FP precisas y confiables. En esta publicación de blog, exploraremos cómo medir la polarización de fluorescencia, desde los principios básicos hasta las consideraciones prácticas.

Principios básicos de polarización de fluorescencia

La polarización de fluorescencia se basa en el hecho de que cuando una molécula fluorescente se excita por la luz polarizada, la luz emitida también está polarizada. El grado de polarización de la luz emitida depende del movimiento de rotación de la molécula fluorescente durante la vida útil de la fluorescencia. Si la molécula es grande o está unida a una macromolécula, su movimiento de rotación está restringido y la luz emitida permanece altamente polarizada. Por el contrario, si la molécula es pequeña y libre en solución, su movimiento de rotación es rápido y la luz emitida se despolariza.

La polarización de la fluorescencia se cuantifica por el valor de polarización (P), que se define como la diferencia entre las intensidades de los componentes polarizados vertical y horizontalmente de la luz emitida dividida por su suma:

[P = \ frac {i _ {\ paralelo} -i _ {\ perp}} {i _ {\ parallel}+i _ {\ perp}}]

donde (i _ {\ paralelo}) es la intensidad de la luz emitida polarizada verticalmente, y (i _ {\ perp}) es la intensidad de la luz emitida polarizada horizontalmente.

Instrumentación para medir la polarización de fluorescencia

Para medir la polarización de fluorescencia, necesita un detector de fluorescencia equipado con óptica de polarización. Nuestra empresa ofrece una gama de detectores de fluorescencia de alta calidad, incluidos losDetector de fluorescencia isotérmicay elDetector de fluorescencia isotérmica digital, que están diseñados específicamente para mediciones de FP precisas y sensibles.

Estos detectores generalmente consisten en los siguientes componentes:

1. Fuente de luz: Se usa una fuente de luz, como una lámpara de xenón o un láser, para generar la luz de excitación. La luz debe ser polarizada antes de que llegue a la muestra.
2. Polarizadores: Los polarizadores se utilizan para controlar la polarización de la luz de excitación y emisión. El polarizador de excitación se coloca en el camino de la luz de excitación para garantizar que esté polarizado linealmente. El polarizador de emisión se coloca frente al detector para medir los componentes polarizados vertical y horizontalmente de la luz emitida.
3. Titular de la muestra: Se utiliza un soporte de muestra para mantener la muestra en la ruta de la luz de excitación. Debe diseñarse para minimizar la dispersión de la luz y la fluorescencia de fondo.
4. Detector: Se utiliza un fotodetector, como un tubo de fotomultiplicador (PMT) o un dispositivo de carga acoplado (CCD), para medir la intensidad de la luz emitida. El detector debe poder medir las intensidades de los componentes polarizados vertical y horizontalmente por separado.

Configuración experimental para mediciones de polarización de fluorescencia

Los siguientes pasos están involucrados en la configuración de un experimento para medir la polarización de fluorescencia:

1. Seleccione la sonda fluorescente apropiada: Elija una sonda fluorescente que sea adecuada para su aplicación. La sonda debe tener un alto rendimiento cuántico y una larga vida útil de fluorescencia.
2. Preparar la muestra: Prepare la muestra disolviendo la sonda fluorescente en un tampón adecuado. Si está estudiando una interacción de unión, agregue el ligando o la macromolécula a la muestra a la concentración apropiada.
3. Calibrar el instrumento: Calibre el detector de fluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto puede implicar ajustar la ganancia del detector, establecer las longitudes de onda de excitación y emisión, y medir la fluorescencia de fondo.
4. Medir los valores de polarización: Coloque la muestra en el soporte de la muestra y mida las intensidades de los componentes polarizados vertical y horizontalmente de la luz emitida. Calcule el valor de polarización utilizando la fórmula mencionada anteriormente.

Factores que afectan las mediciones de polarización de fluorescencia

Varios factores pueden afectar la precisión y confiabilidad de las mediciones de polarización de fluorescencia:

1. Temperatura: El movimiento de rotación de la molécula fluorescente es dependiente de la temperatura. Un aumento en la temperatura conduce a un aumento en el movimiento de rotación y una disminución en el valor de polarización. Por lo tanto, es importante mantener una temperatura constante durante la medición.
2. Viscosidad del solvente: La viscosidad del solvente afecta el movimiento de rotación de la molécula fluorescente. Un disolvente más viscoso restringe el movimiento de rotación y aumenta el valor de polarización.
3. Concentración de la sonda fluorescente: La concentración de la sonda fluorescente puede afectar el valor de polarización. A altas concentraciones, pueden ocurrir el autoadrenaje y la agregación de la sonda, lo que lleva a mediciones inexactas.
4. Foto -blanqueo: El foto -blanqueo es la destrucción irreversible de la molécula fluorescente por la luz de excitación. Puede conducir a una disminución en la intensidad de fluorescencia y afectar la medición de polarización. Para minimizar el foto -blanqueo, use una luz de excitación de baja intensidad y tiempos de exposición cortos.

Aplicaciones de polarización de fluorescencia

La polarización de fluorescencia tiene una amplia gama de aplicaciones en varios campos:

1. Descubrimiento de drogas: FP se usa para estudiar las interacciones vinculantes entre los medicamentos y sus objetivos. Al medir el valor de polarización, puede determinar la afinidad de unión y la constante de disociación del complejo fármaco.
2. Inmunoensayos: Los inmunoensayos basados ​​en FP se utilizan para detectar la presencia de antígenos o anticuerpos en muestras biológicas. La unión del antígeno al anticuerpo marcada con la sonda fluorescente marcada conduce a un cambio en el valor de polarización, que puede usarse para cuantificar el analito.
3. Análisis de ácido nucleico: FP puede usarse para estudiar la hibridación de ácidos nucleicos. La unión de un oligonucleótido marcado con fluorescencia a su secuencia complementaria conduce a un cambio en el valor de polarización, que puede usarse para detectar y cuantificar el ácido nucleico objetivo.

Solución de problemas de mediciones de polarización de fluorescencia

Si encuentra problemas durante las mediciones de polarización de fluorescencia, los siguientes consejos de resolución de problemas pueden ser útiles:

1. Valores bajos de polarización: Si los valores de polarización son más bajos de lo esperado, verifique factores como alta temperatura, baja viscosidad del disolvente o alta concentración de la sonda fluorescente.
2. Alta fluorescencia de fondo: La alta fluorescencia de fondo puede ser causada por impurezas en la muestra o en el solvente, o por dispersión de luz. Purifique la muestra y use un solvente limpio. Asegúrese de que el soporte de muestra esté limpio y libre de rasguños.
3. Medidas inconsistentes: Las mediciones inconsistentes pueden deberse al foto -blanqueo, una mala alineación de los polarizadores o fluctuaciones en la fuente de luz. Minimice el foto -blanqueo, verifique la alineación de los polarizadores y asegúrese de que la fuente de luz sea estable.

Conclusión

La medición de la polarización de fluorescencia es una técnica valiosa para estudiar las interacciones de unión y la dinámica molecular de las moléculas fluorescentes. Como proveedor de detector de fluorescencia, estamos comprometidos a proporcionar instrumentación de alta calidad y soporte técnico para ayudarlo a lograr mediciones de FP precisas y confiables. Ya sea que esté trabajando en el descubrimiento de fármacos, los inmunoensayos o el análisis de ácido nucleico, nuestroDetector de fluorescencia isotérmicayDetector de fluorescencia isotérmica digitalpuede satisfacer sus necesidades.

Si está interesado en comprar nuestros detectores de fluorescencia o tiene alguna pregunta sobre las mediciones de polarización de fluorescencia, contáctenos para una consulta detallada y una negociación de adquisiciones. Nuestro equipo de expertos está listo para ayudarlo a seleccionar el instrumento más adecuado para su aplicación.

Referencias

1. Lakowicz, Jr (2006). Principios de espectroscopía de fluorescencia. Springer Science & Business Media.
2. Szollosi, J. y Damjanovich, S. (2004). Polarización de fluorescencia: una guía práctica. En protocolos de corriente en citometría (pp. 1 - 17). John Wiley & Sons, Inc.