La ADN polimerasa es una enzima crucial en la biología molecular, que juega un papel central en los procesos de replicación y reparación de ADN. En el laboratorio, la purificación de la ADN polimerasa es un proceso meticuloso y múltiple que requiere una planificación y ejecución cuidadosa. Como proveedor de ADN polimerasa, estoy bien, versado en las complejidades de este proceso de purificación, y me gustaría compartir los detalles con usted.
Pasos iniciales: crecimiento celular y lisis
El primer paso para purificar la ADN polimerasa a menudo comienza con células en crecimiento que expresan la enzima. Comúnmente, las bacterias como Escherichia coli se usan como células huésped porque son fáciles de cultivar, crecen rápidamente y pueden diseñarse genéticamente para sobreexpresar la ADN polimerasa objetivo. Las bacterias generalmente se cultivan en un medio de cultivo adecuado en condiciones controladas de temperatura, pH y aireación. Por ejemplo, E. coli a menudo se cultiva a 37 ° C en un medio rico como Luria - Bertani (LB) caldo.
Una vez que las células han alcanzado una densidad apropiada, se cosechan por centrifugación. El sedimento celular se resuspende en una solución de tampón. Para liberar la ADN polimerasa de las células, se lleva a cabo un paso de lisis. Existen varios métodos para la lisis celular, incluidos los métodos mecánicos (como la sonicación), los métodos químicos (usando detergentes como Triton X - 100) y métodos enzimáticos (usando lisozima para descomponer la pared celular bacteriana). La sonicación es una opción popular, ya que puede interrumpir efectivamente las células sin causar daño significativo a la enzima. Sin embargo, debe controlarse cuidadosamente para evitar el calentamiento de la muestra, lo que podría desnudar la ADN polimerasa.
Preparación y aclaración del extracto crudo
Después de la lisis celular, la mezcla resultante contiene una variedad de componentes celulares, que incluyen proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y restos celulares. Esto se conoce como el extracto crudo. Para eliminar los restos a gran escala, el extracto crudo se centrifugó a alta velocidad. El sobrenadante, que contiene las proteínas solubles, incluida la ADN polimerasa, se recolecta cuidadosamente.
A veces, el extracto crudo aún puede contener una cantidad significativa de ácidos nucleicos que pueden interferir con los pasos de purificación posteriores. Para eliminar estos ácidos nucleicos, se puede realizar un paso de precipitación utilizando un compuesto policial como la polietilenimina (PEI). PEI se une a los ácidos nucleicos cargados negativamente, lo que hace que precipitaran, que luego se pueden eliminar por centrifugación.
Purificación cromatográfica
La cromatografía es la piedra angular de la purificación de ADN polimerasa. Existen varios tipos de técnicas de cromatografía que se pueden usar, cada una basada en diferentes principios de separación.
Ion - cromatografía de intercambio
Ion: la cromatografía de intercambio es a menudo el primer paso cromatográfico en el proceso de purificación. Separa proteínas en función de su carga neta. Las ADN polimerasas tienen una carga característica a un pH dado, lo que les permite unirse a una resina cargada positivamente (anión - intercambio) o cargado negativamente (catión - intercambio). Por ejemplo, si la ADN polimerasa tiene una carga negativa neta a un pH particular, se puede usar una resina de intercambio de aniones como la celulosa dietilaminoetil (DEAE). El extracto crudo se carga en la columna, y la ADN polimerasa se une a la resina, mientras que otras proteínas con diferentes cargas pasan. La ADN polimerasa unida se puede eluir aumentando la concentración de sal en el tampón. Este método es efectivo para eliminar muchos contaminantes y puede enriquecer significativamente la ADN polimerasa en la muestra.
Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad es un método de purificación altamente específico. Aprovecha la interacción específica entre la ADN polimerasa y un ligando inmovilizado en una resina. Un enfoque común es usar un sistema de etiqueta His. Si la ADN polimerasa se ha diseñado genéticamente para contener una etiqueta de histidina (His - TAG), se puede usar una resina de ácido nitrilotriacético (NI -NTA). La etiqueta His - se une específicamente a los iones de níquel en la resina, lo que permite que la ADN polimerasa se retenga selectivamente en la columna. Otras proteínas que no tienen la etiqueta His pasarán a través de la columna. La ADN polimerasa unida se puede eluir agregando imidazole al tampón, que compite con la etiqueta His para unirse a los iones de níquel.
Otro tipo de cromatografía de afinidad que se puede usar es la cromatografía de afinidad de ADN. Dado que la ADN polimerasa tiene una afinidad natural por el ADN, se puede usar una resina que contiene ADN. La ADN polimerasa se une al ADN en la resina y se eliminan otras proteínas de unión a ADN de ADN. La ADN polimerasa unida se puede eluir cambiando las condiciones del tampón, como aumentar la concentración de sal o agregar un ADN de la competencia.
Tamaño - Cromatografía de exclusión
Tamaño - Cromatografía de exclusión, también conocida como cromatografía de filtración en gel, separa las proteínas según su tamaño. La columna está llena de cuentas porosas. Las proteínas más pequeñas pueden ingresar a los poros de las perlas y tener una ruta más larga a través de la columna, mientras que las proteínas más grandes pasan a través de los espacios entre las perlas y eluden antes. Este método es útil para eliminar los agregados restantes o los contaminantes pequeños de peso molecular. También se puede usar para determinar el peso molecular de la ADN polimerasa purificada.
Purificación final y control de calidad
Después de los pasos cromatográficos, la ADN polimerasa suele ser altamente purificada. Sin embargo, todavía puede haber algunos contaminantes menores presentes. Se puede llevar a cabo un paso de pulido final, como la cromatografía de interacción hidrofóbica o la cromatografía de fase inversa, para purificar aún más la enzima.
Una vez que se completa la purificación, las rigurosas medidas de control de calidad son esenciales. La pureza de la ADN polimerasa se puede evaluar utilizando técnicas como el dodecil sulfato de sodio - electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS - Página). Una sola banda en el gel indica una muestra de alta pureza. La actividad de la ADN polimerasa se puede medir usando un ensayo de síntesis de ADN in vitro. La actividad específica, que es la cantidad de actividad enzimática por unidad de proteína, es un parámetro importante para evaluar la calidad de la ADN polimerasa purificada.
Otras enzimas relacionadas y nuestra cartera de productos
Además de la ADN polimerasa, nuestra compañía también ofrece una gama de otras enzimas de alta calidad para la investigación de laboratorio. Por ejemplo, tenemos elProteína GP41 2.0, que juega un papel importante en los procesos de replicación de ADN. Otro producto es elExonucleasa III 2.0, que es útil para los estudios de reparación y modificación del ADN. Y nuestroSC Reca 2.0está involucrado en mecanismos de recombinación homóloga y reparación de ADN.
Conclusión
La purificación de la ADN polimerasa en el laboratorio es un proceso complejo pero gratificante. A través del crecimiento celular cuidadoso, la lisis, la purificación cromatográfica y el control de calidad, podemos obtener la ADN polimerasa altamente pura y activa. Como proveedor de ADN polimerasa, estamos comprometidos a proporcionar los productos de más alta calidad para satisfacer las necesidades de la comunidad científica. Si está interesado en nuestra ADN polimerasa u otros productos enzimáticos, lo invitamos a contactarnos para adquisiciones y más discusiones. Siempre estamos listos para ofrecer asesoramiento y apoyo profesional para garantizar que tenga los mejores reactivos adecuados para sus proyectos de investigación.
Referencias
- Sambrook, J. y Russell, DW (2001). Clonación molecular: un manual de laboratorio. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Scopes, RK (1994). Purificación de proteínas: principios y práctica. Springer - Verlag.
- Deutscher, MP (1990). Guía para la purificación de proteínas. Prensa académica.