¡Hola! Como proveedor de kits de amplificación isotérmica de ARN, a menudo me hacen esta pregunta: "¿Se puede utilizar el kit de amplificación isotérmica de ARN para el análisis cuantitativo del ARN?" Bueno, vamos a sumergirnos y desglosarlo.
En primer lugar, ¿cuál es la amplificación isotérmica de ARN? A diferencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) más bien conocida que necesita múltiples ciclos de temperatura, la amplificación isotérmica de ARN ocurre a una temperatura constante. Es una tecnología bastante ingeniosa que ha ganado popularidad en los últimos años.
Una de las principales ventajas de usar un kit de amplificación isotérmica de ARN es su simplicidad. No necesita un termociclador elegante con todas esas temperaturas: cambiando la configuración. Esto lo hace más accesible, especialmente para las pruebas de cuidados de puntos o en configuraciones limitadas de recursos. Pero la gran pregunta sigue siendo: ¿se puede utilizar para el análisis cuantitativo?
Comencemos mirando los principios básicos del análisis cuantitativo del ARN. En pocas palabras, queremos saber exactamente cuánto de una molécula de ARN específica está presente en una muestra. Esto es crucial en muchos campos, como la virología para medir la carga viral o en los estudios de expresión génica para comprender cómo se están regulando los genes.
Los métodos tradicionales para el análisis cuantitativo de ARN, como la PCR de tiempo real (QPCR), han sido el estándar de oro. QPCR utiliza colorantes fluorescentes o sondas para detectar la cantidad de ADN amplificado (que se transcribe inversa a partir de ARN) en tiempo real. El ciclo en el que la fluorescencia cruza un cierto umbral (valor CT) se usa para calcular la cantidad inicial de ARN en la muestra.
Ahora, para los kits de amplificación isotérmica de ARN. Estos kits generalmente funcionan usando enzimas que pueden amplificar el ARN a una temperatura constante. Por ejemplo, elMira ARN ISOTHERMAL SAPTAP AMPLIFICACIÓN BÁSICO - IIes uno de nuestros productos que utiliza esta tecnología. Puede amplificar rápidamente los objetivos de ARN, pero ¿podemos usarlos para cuantificarlos?
La respuesta es un poco más complicada que un simple sí o no. Por un lado, hay algunos desafíos. A diferencia de QPCR, que tiene un método bien establecido para la cuantificación basado en el valor de CT, la amplificación isotérmica de ARN no tiene un equivalente directo. La cinética de amplificación en los sistemas isotérmicos puede ser más complejo, y factores como las condiciones de reacción iniciales, la actividad enzimática y la disponibilidad del sustrato pueden tener un mayor impacto en la tasa de amplificación.
Sin embargo, eso no significa que sea imposible. Algunos investigadores han presentado formas creativas de hacer que la amplificación isotérmica de ARN sea adecuada para el análisis cuantitativo. Un enfoque es usar estándares internos. Al igual que en QPCR, puede agregar una cantidad conocida de una molécula de ARN de control a su muestra. Al comparar la amplificación del ARN objetivo con el del ARN de control, puede obtener una estimación de la cantidad de ARN objetivo.
Otra forma es usar métodos de detección basados en fluorescencia en combinación con la amplificación isotérmica de ARN. Por ejemplo, algunos de nuestros kits, como elMira ARN Isotérmico Kit de amplificación rápida Nucleic ácido Fuerra de prueba, se puede modificar para incorporar sondas fluorescentes. Al medir la intensidad de fluorescencia con el tiempo, puede monitorear el proceso de amplificación y potencialmente usarlo para cuantificar.
También hablemos sobre las ventajas de usar nuestros kits de amplificación isotérmica de ARN para el análisis cuantitativo en comparación con los métodos tradicionales. Como mencioné anteriormente, la simplicidad y la velocidad son grandes ventajas. Con nuestros kits, puede obtener resultados en un tiempo mucho más corto en comparación con QPCR, que generalmente lleva una hora o más. Esto es especialmente importante en situaciones en las que el diagnóstico rápido es crucial, como durante un brote de enfermedad infecciosa.
Además, nuestros kits son altamente específicos. Están diseñados para apuntar solo a las secuencias de interés de ARN, reduciendo las posibilidades de resultados falsos positivos. Esta especificidad es esencial para un análisis cuantitativo preciso, ya que desea asegurarse de que solo está midiendo el ARN que le interesa.
Ahora, toquemos algunos de los aspectos prácticos. Si está considerando usar nuestros kits de amplificación isotérmica de ARN para el análisis cuantitativo, hay algunas cosas a tener en cuenta. Primero, debe optimizar las condiciones de reacción. Esto incluye cosas como la concentración de las enzimas, cebadores y otros reactivos. Una reacción optimizada bien le dará más resultados reproducibles, lo cual es clave para una cuantificación precisa.
En segundo lugar, debe validar su método cuantitativo. Esto significa ejecutar múltiples réplicas de muestras conocidas y comparar los resultados con un método de referencia, como QPCR. Al hacer esto, puede establecer la precisión y precisión de su análisis cuantitativo utilizando nuestros kits de amplificación isotérmica de ARN.
También tenemos otro gran producto, elMira ADN Kit de amplificación rápida isotérmica básica. Aunque es para la amplificación del ADN, los principios del análisis cuantitativo pueden ser similares de alguna manera. Se puede usar en combinación con el análisis de ARN en algunos casos, por ejemplo, cuando desea estudiar la relación entre los niveles de ADN y ARN en una célula.
En conclusión, si bien los kits de amplificación isotérmica de ARN enfrentan algunos desafíos cuando se trata de análisis cuantitativo de ARN, es posible con el enfoque correcto. Nuestra empresa se compromete a proporcionar kits de alta calidad y apoyar a nuestros clientes para explorar el potencial de estas tecnologías para aplicaciones cuantitativas.
Si está interesado en aprender más sobre nuestros kits de amplificación isotérmicos de ARN o desea discutir cómo pueden usarse para sus necesidades de análisis cuantitativos específicos, nos encantaría saber de usted. Solo comuníquese con nosotros para comenzar una conversación sobre adquisiciones y cómo podemos trabajar juntos para cumplir con sus objetivos de investigación.
Referencias
- Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N. y Hase, T. (2000). Amplificación isotérmica mediada de bucle de ADN. Investigación de ácidos nucleicos, 28 (12), E63 - E63.
- Gootenberg, JS, Abudayyeh, Oo, Lee, JW, Essletzbichler, P., Dy, A., Joung, J., ... y Zhang, F. (2018). Detección de ácido nucleico con CRISPR - CAS13A/C2C2. Science, 360 (6387), 439 - 444.